Najvýznamnejšie výsledky

Rekombinantnou DNA technológiou sa pripravil jednoduchší vírus bovinnej leukémie s cieľom zistiť, či nie je možné využiť takto modifikovaný vírus ako potenciálnu retrovírusovú vakcínu proti komplexnejším retrovírusom. Zistilo sa, že takýto vírus bol schopný infikovať heterológne bunky in vitro a replikovať sa v nich. V lymfocytoch modelových zvierat (potkanoch) sa dokázala prítomnosť vírus-špecifickej DNA a RNA. Vírusom infikované zvieratá produkovali anti-vírusové protilátky. Výsledky poukazujú na možnosť využitia jednoduchších retrovírusov ako imunogénov.

Č. Altaner a kol. (2/4027/97)

Na definíciu leukemickej bunky sa použil nový parameter, ktorý umožňuje exaktné hodnotenie priemernej intenzity fluorescencie vyjadrenej počtom antigénových molekúl na bunku. Obohatili sa dostupné literárne údaje o niektoré nové poznatky, definujúce leukemickú bunku odlišnou hustotou antigénu, v porovnaní s jej neleukemickým analógom. Výsledky možno využiť i na dôkaz minimálnej reziduálnej choroby (MRD), pretože sa dokázalo, že leukemické bunky si zachovávajú pre jednotlivé znaky rovnaký počet molekúl v čase diagnózy, v remisii s prítomnou MRD a pri relapse choroby.

O. Babušíková et al. (2/1341/97)

Molekulárno-genetickou analýzou pacienta s Ito hypomelanózou (mozgový nádor a translokácia X; 17) sa presne určilo miesto zlomu na oboch chromozómoch. Kým na chromozóme X sa neidentifikovali žiadne gény, v prípade chromozómu 17 sa detegovali 2 gény lokalizované v mieste zlomu: FXR2 (fragile X mental retardation syndrome related protein) a SHBG (Human sex hormone - binding protein). Dosiahnuté výsledky prispievajú k mapovaniu chromozómu X a môžu sa využiť pre identifikáciu tejto formy hypomelanózy a pre jej včasnú diagnostiku.

V. Zajac a kol. (ERB CIPD CT 94 0401, grant Európskeho spoločenstva).

Výsledky významné z hľadiska nových liečebných postupov

Technikami rekombinantnej DNA technológie sa pripravil retrovírusový vektor obsahujúci tymidínkinázu vírusu Herpes simplex (HSVtk). Vyselektovali sa vysokoprodukčné jednobunkové klony a testovali sa na schopnosť prenosu HSVtk do nádorových buniek in vitro a na citlivosť k účinku gancikloviru. Najúčinejšie klony sú vhodné na použitie v génovej terapii nádorov.

Testovala sa účinnosť pripraveného retrovírusového vektora obsahujúceho thymidínkinázu virusu Herpes simplex (HSVtk) v liečbe potkaních nádorov. Potkanom sa inokulovali s.c. alebo intracerebrálne potkanie gliómové bunky. Následne sa zvieratám podávali terapeutické bunky priamo do transplantovaného nádora. Po terapii ganciklovirom sa dosiahla regresia nádorov u niektorých zvierat. Snahou uvedených pokusov je zvýšiť účinnosť terapie prenosom novo modifikovaných terapeutických vektorov do nádorov.

Pre liečbu kožných melanómov sa navrhli progresívne terapeutické postupy na zasiahnutie nádoru, v ktorom sú T-bunky aktivované peptidmi odvodenými z melanocytárnych antigénov gp100 MART-1, tyrozináza a TRP-1. Expresia týchto antigénov sa zisťovala v širokom súbore očných melanocytárnych lézií. Vysoká expresia týchto proteínov sa zistila u 80% sledovaných lézií, pričom pozitivitu vykazovalo 75-100% nádorových buniek. Tento výsledok potvrdzuje využiteľnosť uvedeného imonoterapeutického prístupu v liečbe očných melanómov.

Využitie molekulárno-biologických metód pre včasnú diagnózu rakoviny

Presymptomatická diagnostika geneticky podmienenej rakoviny hrubého čreva (familiárnej adenomatóznej polypózy - FAP) pokračovala kompletizáciou ďalších podozrivých rodín. Metódami molekulovej genetiky - heteroduplexnou analýzou (HDA), testom na skrátený proteín (PTT) a metódou jednovláknového konformačného polymorfizmu (SSCP) sa identifikovali mutácie APC génu, zodpovedného za vznik tohto ochorenia u 12 rodín. Na základe našich analýz a gastroenterologických vyšetrení sa u troch FAP pozitívnych pacientov chirurgicky odstránila časť hrubého čreva, čím sa odstránilo reálne nebezpečenstvo progresie nádorového ochorenia a ich šanca na prežitie je až 90%.

Metódou detekcie instability mikrosatelitovej DNA sa podarilo identifikovať prvého slovenského pacienta suspektného na hereditárnu formu nepolypóznej rakoviny hrubého čreva/konečníka. Uskutočnia sa opakované vyšetrenie a pre včasný záchyt rakoviny sú indikované časté klinické sledovania pacienta.

Zaviedla sa imunohistochemická metóda na zisťovanie skrytých mikrometastáz. Pacientky s invazívnym duktálnym karcinóm prsníka sa vyšetrili pred chemoterapeutickou liečbou. Imunohistochemickým vyšetrením sa hľadali bunky s dvoma epiteliálnymi antigénmi medzi inak normálnymi mezenchymálnymi bunkami kostnej drene. Skryté mikrometastázy sa zistili pred akýmkoľvek zjavným príznakom metastatického šírenia karcinómových buniek. Výsledky predstavujú cennú pomoc pri prognózovaní vývoja rakoviny prsníka.

V spolupráci s I. a II. neurologickou klinikou FN a LF UK a neurochirurgickou klinikou NsP sa rozpracovala diagnostika neurofibromatózy. Od pacientov podozrivých z ochorenia neurofibromatóza 2 (NF 2) sa získal biologický materiál, z ktorého sa izolovala genómová DNA. Diagnostika na molekulárnej úrovni bude pokračovať v budúcom roku. Na základe histopatologických vyšetrení sa diagnostikovali nádory nervového systému patriace pod NF 2 - schwanóm a meningióm.

Získali sa ďalšie výsledky pri výskume expresie endogénnych ľudských retrovírusov so zameraním na diagnostiku a prognózu ľudských testikulárnych nádorov. Pokračovalo sa v stanovovaní reakcií sér pacientov so seminómami s antigénom získaným nablotovaním lyzátu buniek teratokarcinómovej línie Tera 1. Pretože väčšina sér vykazuje v blote slabé a často veľmi početné reakcie, t.j. reakcie s viacerými proteínmi, sledovali sa i séra viacerých zdravých ľudí. Reakcie v imunoblote zdravých jedincov sú podobné ako reakcie sér pacientov s lokalizovaným nádorom i pacientov s metastázami. Ako kontrola špecificity reakcií sa použije leukemická línia K562.

Novšie imunologické podklady pre diagnostiku, prognózu a liečbu krvných malignít

Pri hodnotení výsledkov imunofenotypizácie T-akútnych lymfoblastických leukémií (T-ALL) sa dokázala značná heterogenita diferenciačných znakov, ktorá neumožňuje ich relevantnú subklasifikáciu podľa navrhnutého modelu T-bunkovej fyziologickej diferenciácie. Vypracovala sa preto zjednodušená klasifikácia T-ALL na základe expresie znaku CD3 na membráne alebo v cytoplazme. Pri dôkladnom klinickom zhodnotení sa ukázalo, že sa javí výhodným a postačujúcim členenie T-ALL do týchto dvoch fenotypových skupín (mCD3- a mCD3+). Náš výskum súčasne potvrdil prítomnosť netypických/aberantných T-bunkových fenotypov - sú to tie, ktoré sa líšia od fenotypov typických T-ALL a od fenotypov periférnych T lymfocytov zdravého jedinca. Tento fenomén umožňuje odlíšenie buniek T-ALL od reziduálnych/zvyškových zdravých buniek T a môže poskytnúť i isté prognostické faktory.

Pre určenie významu membránového enzýmu dipeptidyl peptidáza IV (DPP IV) v procese aktivácie a proliferácie lymfocytov T sa podrobne skúmal vzťah medzi DPP IV-pozitívnymi bunkami, množstvom argyrofilných proteínov (AgNOR) a proliferačnými znakmi CD38 a CD71 v leukemických bunkách pacientov s T-ALL. Výsledky ukázali, že pozitivita DPP IV významne koreluje s expresiou proliferačných imunofenotypových znakov. Vysoké priemerné počty AgNOR v jadre leukemických buniek pacientov s T-ALL potvrdili, že leukemické bunky so silne pozitívnou reakciou na DPP IV sa nachádzajú v proliferačnej fáze bunkového cyklu.

Chemoterapia nádorov a výskum mechanizmu účinku nových chemoterapeutík

Uskutočnil sa výskum mechanizmu účinku nových inhibítorov ribonukleotidreduktázy (didox a amidox) a preukázalo sa, že mechanizmus inhibície rastu malígnych buniek týmito zlúčeninami je sčasti založený na komplexácii atómu železa, ktorý je súčasťou aktívneho miesta enzýmu. Súčasne sa určili základné farmakokinetické parametre pre amidox v žlči a plazme a stupeň metabolizácie tejto látky v podmienkach in vivo.

Verejné zdravotníctvo - decízna a exekutívna oblasť

Vysoké hodnotenie údajov o incidencii zhubných nádorov na Slovensku, spolu s ich dlhým časovým radom a použitím moderných klasifikácií, viedlo k ich opätovnému publikovaniu v náročnej monografii "Cancer Incidence in Five Continents, Vol.VII." Takto zostávajú údaje zo Slovenska i naďalej indikátorom pre celú strednú Európu pri medzinárodných porovnaniach geografickej distribúcie a časových trendov vývoja týchto ochorení v európskom a globálnom merítku. Príspevok je náročnou revíziou asi 80.000 prípadov ochorení, ktoré sa na Slovensku vyskytli v rokoch 1988-1992, prezentovaných formou "case listing" spolu s doplnením tohto zoznamu s korešpondujúcimi počtami zomretých na nádorové choroby - asi 55.000 osôb v tom istom období (kritérium spoľahlivosti údajov o incidencii). Zistila sa kontinuita údajov zo Slovenska od roku 1973, pričom naše údaje za 20-ročné obdobie predstavujú významný indikátor vývoja nádorov v celej strednej a východnej Europe (ostatné krajiny sú zastúpené iba údajmi z malých, regionálnych registrov, prípadne pokrývajú iba krátke obdobie posledných 10 rokov).

V spolupráci s kolegami z Českej republiky a susediacich krajín strednej Európy sa ukončil medzinárodný projekt zameraný na výskum prognóz mortality na najvýznamnejšiu lokalizáciu v rámci nádorov - na zhubné nádory pľúc v ČR, SR a susediacich krajinách. Práca sa prezentovala na 7. svetovom kongrese o pľúcnej rakovine v Dubline, Írsko, v auguste 1997 a prijala sa do tlače v časopise NEOPLASMA pre rok 1998. Prognózy mortality na zhubné nádory pľúc poukazujú na ich stabilizáciu až pokles u mužov v Poľsku, ČR a SR, ale i na ďalší rast v Maďarsku. Vážnou skutočnosťou je očakávaný, viac alebo menej vyznačený vzostup týchto nádorov u žien vo všetkých stredoeurópskych krajinách.

Urobila sa finálna revízia príspevku zo Slovenska (zhubné nádory u detí v rokoch 1980-1989) pre monografiu "International Incidence of Childhood Cancer, Vol. II" - v tlači - Medzinárodná agentúra pre výskum rakoviny (IARC) Lyon, vyjde v roku 1998. Príspevkom zo Slovenska za desaťročie 1980-1989 sa znovu doplnil dlhší časový rad od roku 1970, pričom naše údaje opäť reprezentujú celú strednú a východnú Európu z hľadiska vývoja incidencie tumorov v detskom veku.

Výsledky získané v oblasti molekulárnej biológie, genetiky a biochémie

Identifikoval sa proteazóm 26S ako hlavný proteolytický systém zodpovedný za rýchlu degrádaciu c-Myb proteínu v hematopoetických bunkách. Zároveň sa dokázalo, že onkogénne aktivovaná forma c-Myb proteínu skráteného na COOH konci (CT-Myb) bola oveľa stabilnejšia v porovnaní s nemutovaným proteínom. Experimenty urobené v in vitro systéme ukázali, že CT-Myb nie je efektívne modifikovaný ubiquitínom, naznačujúc, že defekt v tejto modifikácii je zodpovedný za zvýšenú stabilitu zmutovaného proteínu. Predĺžený polčas rozpadu CT-Myb proteínu vysvetľuje aspoň čiastočne jeho zvýšený transformačný potenciál.

Je známe, že bunky vystavené nutričnému stresu pred UV ožiarením výrazne zvýšia rezistenciu k UV žiareniu pri súčasnom poklese frekvencie UV-indukovaných mutácií. Pretože tento jav je závislý od uvr génov, predpokladalo sa, že stresové podmienky stimulujú excíznu opravu. Zistili sme, že stresové podmienky vedú k indukcii OmpT proteázy (outer membrane protease T) a súčasne, v rozpore s uvedeným predpokladom, k predčasnému ukončeniu excíznej opravy.

Podal sa prvý dôkaz o prítomnosti O6-alkylguanín-alkyltransferáz v termofilných mikroorganizmoch skupín Crenarchaeota a Euryarchaeota. Popísali sa štyri rozdielne AT-ázy a charakterizovali sa ich špecifické enzymatické aktivity, reakčná kinetika, optimálna teplota reakcie, termostabilita, substrátová špecificita a veľkosť jednotlivých proteínov. Predpokladá sa obecnejšie metodologické využitie uvedených AT-áz v molekulárno-biologickom výskume.

Získali sa ďalšie poznatky o priebehu odstraňovania poškodení DNA v bunkách, ktoré regulujú imunitné procesy. Zistilo sa, že poškodenia DNA, ktoré vznikajú po ožiarení UV-lúčmi (konkrétne pyrimidínové diméry) sa v aktivovaných CD4+ lymfocytoch odstraňujú iba v limitovanej časti DNA a to v prepisujúcich sa génoch. V neaktívnom géne nedochádza k žiadnemu odstraňovaniu pyrimidínových dimérov.

Citlivosť imunologického stanovenia alkyltransferáz, ktoré predstavujú potenciálne biomarkery alkylačného poškodenia pri chemoterapii nádorov, sa podarilo zvýšiť zavedením metódy chemoluminiscencie. Kvantifikácia príslušného proteínu je takto možná priamo z exponovaného filmu.

Pomocou kométového testu a metódy alkalického odvinutia DNA sa dokázalo, že pečeňové nádorové bunky HepG2 vo vyššej miere aktivujú benzo[a]pyrén, 7H dibenzo[c,g]karbazol a N-metyl- dibenzo [c,g]karbazol ako externá metabolická frakcia S9 ľudských buniek VH10+. V ovplyvnených ľudských bunkách VH10 bola hladina poškodení výrazne zvýšená len za spoluúčasti inhibítorov syntézy DNA. Transfekované škrečacie bunky V79, schopné stabilnej expresie ľudského cytochrómu P450 h1A1 a v menšej miere aj bunky, obsahujúce cytochrómy P450 h1A2 a P450 r2B1, mali schopnosť aktivovať skúmané karcinogény.

Pri zisťovaní účinku reparačných enzýmov DNA (endonukleázy III, exonukleázy III, UV endonukleázy a FaPy glykozylázy) sa ukázalo, že poškodenia DNA, indukované v ľudských bunkách VH10 S9- aktivovaným benzo[a]pyrénom sú v približne rovnakej miere reparované všetkými skúmanými enzýmami; poškodenia indukované dibenzokarbazolom sú reparované najmä endonukleázou III, menej exonukleázou III a UV endonukleázou a poškodenia, indukované metyldibenzokarbazolom sú reparované v rovnakej miere endonukleázou III a FaPy glykozylázou. Využitie príslušných reparačných enzýmov pomáha určiť profil poškodenej ľudskej DNA v chemicky ovpyvnených bunkách.

Predbežné výsledky svedčia o tom, že u pacientov s rôznymi formami leukémie sa nevyskytuje zvýšená hladina poškodení DNA v periférnych krvných lymfocytoch alebo v bunkách kostnej drene. Chemoterapia má za následok signifikantné, ale variabilné zvýšenie poškodení DNA u všetkých skúmaných pacientov. Po liečbe sa pozorovalo zníženie hladiny poškodení DNA. Vzorky, odobraté pred liečbou u niektorých pacientov prejavovali zvýšenú hladinu zlomov po aplikácii reparačných enzýmov endonukleázy III a FaPy glykozylázy, čo svedčí o tom, ža v rakovinových bunkách pravdepodobne nastáva akumulácia niektorých endogénnych poškodení.

Skúmala sa schopnosť antioxidantov redukovať hladinu poškodení DNA, vyvolaných v cicavčích bunkách genotoxickými faktormi. Znížená hladinu poškodení DNA sa hodnotila jednak jednobunkovou gélovou elektroforézou, jednak pomocou hladiny indukovaných mikrojadier. Najpodrobnejšie sa skúmal stobadín, látka s kardioprotektívnym účinkom. Zistilo sa, že v škrečacích bunkách V79 ovplyvnených nitrózoguanidínom, stobadín znižuje nielen hladinu génových mutácií indukovaných nitrózoguanidínom (staršie zistenie) ale tiež hladinu zlomov DNA a frekvenciu mikrojadier.

Modifikáciami v jednobunkovej gélovej elektroforéze (pH elektroforetického roztoku=12.1 alebo 13.0) sa charakterizovali zlomy reťazcov DNA, indukované v ovplyvnených škrečacích bunkách V79 peroxidom vodíka alebo nitrózoguanidínom. Získané výsledky svedčia o tom, že na rozdiel od peroxidu vodíka, ktorý vyvoláva hlavne priame zlomy DNA (hladina zlomov bola rovnaká pri vyššom i nižšom pH), všetky zlomy DNA vyvolané nitrózoguanidínom sú vytvorené v polohách lézií, labilných v alkáliách (hladina zlomov sa v závislosti od koncentrácie zvyšovala pri vyššom pH ale žiadne zlomy sa nedetegovali pri nižšom pH).

Študovala sa expresia dvoch ľudských jadrových génov, ktoré kódujú mitochondriálne proteíny, a to izogén ADP/ATP prenášača (ANT2) a cytochróm c1. Expresia génu ANT2 je závislá od fázy bunkového cyklu. V jeho promótore sa identifikovali tri väzbové miesta pre transkripčný faktor Sp1. Dva z nich aktivujú transkripciu, kým tvorba komplexu Sp1 s tretím väzbovým miestom expresiu znižuje. Expresia génu kódujúceho cytochróm c1 je tiež regulovaná cez mnohopočetné Sp1 miesta. Žiadne iné špecifické regulačné elementy sa neidentifikovali v jeho promótore.

Pokračovalo sa v analýze promótora génu AAC3, ktorý kóduje anaeróbnu izoformu ADP/ATP translokátora. Použitím metód "footprintu" a tvorby DNA-proteínových komplexov v prítomnosti špecifických protilátok tzv. "supershiftu" sa v jeho represorickej oblasti URS1 identifikovalo väzbové miesto pre všeobecný transkripčný faktor RAP1. Dokázalo sa, že proteín RAP1 sa viaže na DNA konsensus sekvencie bez ohľadu na akom zdroji uhlíka bunky rastú, ale transkripciu potláča len v prítomnosti neskvasitelného, resp. čiastočne skvasitelného zdroja uhlíka.

Výsledky získané v biologicky orientovanom výskume

Optimalizovala sa izolácia dendritických buniek z periférnej krvi a kostnej drene za účelom charakterizácie tejto subpopulácie antigén-prezentujúcich hematopoetických buniek pre potencionálnu vakcináciu. Na ich izoláciu sa zaviedla progresívna metóda izolácie pomocou magnetických guličiek s využitím protilátok proti monocytovým markerom SWC3 a CD14. Na detekciu miery stimulácie T-buniek prostredníctvom APC in vitro sa zaviedla ELISA metóda s využitím BrDU.

Optimalizovali sa metódy in vitro ovplyvnenia nádorových buniek cytostatikami a metódy cytogenetického sledovania ich účinku na bunky, ktoré sa plánujú využiť pri posudzovaní chemosenzitivity nádorov pacientov.Do cytogenetiky nádorov sa zaviedol výskum inhibítora cytokinézy - cytochalazín B. Pri štúdiu cytogenetických preparátov pripravených z neovplyvnených bunkových kultúr solidných nádorov a bunkových kultúr ovplyvnených inhibítorom cytokinézy cytochalazínom B sa sledoval výskyt mikrojadier v bunkách v závislosti od dávky a dľžky pôsobenia cytochalazínu B. Konfrontovala sa táto metóda detegujúca poškodenia DNA s metódou klasickej analýzy chromozómových aberácií a metódou tzv. "comet assay". Zistila sa zhodnosť výsledkov všetkých uvedených metód. Získané výsledky vytvárajú predpoklad, nahradiť v ďalšej práci pri sledovaní chemosenzitivity či genetickej stability buniek komplikovanú analýzu chromozómových aberácií vo vysoko polyploidných bunkách solidných nádorov mikrojadrovým testom (prípadne doplneným o "comet assay").

V snahe zaviesť ďalší parameter hodnotiaci účinok cytostatika na nádorovú bunku sa sledovali v modelovej situácii hodnoty apoptotického indexu v xenograftoch ovariálnych karcinómov senzitívnych a rezistentných na liečbu platinovými preparátmi. Pri hodnotení terapeutickej odpovede na cytostatický zásah ide totiž o kumuláciu priameho cytotoxického účinku na nádorovú bunku, ako i apoptotického účinku v zmysle indukcie programovanej smrti nádorovej bunky. Podľa štandardných morfologických kritérií sa hodnotil apoptotický index v histologických preparátoch farbených haematoxilín-eozínom v sérii ľudských ovariálnych karcinómov dlhodobo pasážovaných na nahých myšiach. Išlo o spektrum ovariálnych karcinómov, ktoré boli buď extrémne senzitívne v odpovedi na platinové preparáty (cis-platina, karbo-platina, ipro-platina a tetra-platina) alebo boli úplne rezistentné na všetky tieto preparáty, alebo to boli karcinómy, ktoré dobre odpovedali na niektoré a vôbec neodpovedali na iné z uvedených preparátov. V pokusoch sa nedokázal priamy vzťah medzi hodnotami apoptotického indexu a odpoveďou nádorov na terapeutický zásah. Rôznorodosť hodnôt apoptotického indexu v sledovaných nádoroch bez priameho vzťahu k odpovedi na terapeutický zásah upozorňuje na problematiku skúmania biologickej heterogenity bunkových populácií, ktorá zdá sa, viac určuje apoptotickú odpoveď ako samotný cytotoxický zásah.

Niektoré výsledky majú potenciálny význam ako podkladové poznatky pre optimalizáciu chemorádioterapie a sú predmetom ďalšej spolupráce s Klinikou rádioterapie Onkologického ústavu sv. Alžbety (OUSA). Zistil sa cytostatický účinok inhibítora mevalonátovej dráhy (lovastatín) na chemorezistentné (HL-60/VCR: MDR-1, Pgp) ľudské leukemické bunky, pričom tento cytostatický efekt je výraznejší než cytostatický efekt lovastatínu na parentálne, senzitívne HL-60- a chemorezistentné (HL-60/ADR, MRP, p190) leukemické bunky in vitro. Nepotvrdili sme údaje uvádzané v literatúre o rádiosenzibilizačnom účinku lovastatínu a bryostatínu-1 na testovanú chemorezistentnú ovariálnu karcinómovú bunkovú líniu.

Cytofluorometrická analýza apoptózy indukovanej u leukemických bunkových línií inhibítorom IMP dehydrogenázy (benzamid-ribozid ) ukázala, že benzamide-ribozid v kombinácii so staurosporínom indukuje v supra-aditívnej interakcii apoptózu u promyelocytárnej leukemickej bunkovej línie (HL-60).

Podrobný popis ovplyvnenia akumulácie cytostatika daunomycínu inhibítormi proteínkináz (inhibítory proteínkinázy C staurosporín, benzoylderivát staurosporínu GP 41 251 - Ciba Roman">Podrobný popis ovplyvnenia akumulácie cytostatika daunomycínu inhibítormi proteínkináz (inhibítory proteínkinázy C staurosporín, benzoylderivát staurosporínu GP 41 251 - Ciba Geigy a inhibítor tyrozínkinázy genisteín) u rezistentných leukemických buniek s definovaným typom rezistencie na cytostatiká (MDR-1: P-gp, resp. MRP - p190) ukázal výraznú moduláciu rezistencie leukemických bunkových línií farmakologickými inhibítormi proteínkináz.