Komplex DNA ligáza IV-XRCC4 (Dnl4-Lif1)

 

DNA ligáza IV a XRCC4 tvoria komplex (LX), ktorý je schopný spájať zlomené konce DNA. Oba komponenty tohto komplexu majú u cicavcov dôležitý význam pre ich vitalitu, pretože neprítomnosť ktoréhokoľvek z nich vedie k embryonálnej letalite u myší. Bunky defektné v LX komplexe vykazujú citlivosť k ionizujúcemu žiareniu, defektnú opravu DSB, poruchu vo V(D)J rekombinácii a výraznú nestabilitu genómu spôsobujúcu vyššiu incidenciu nádorových ochorení v organizmoch defektných v tomto komplexe. DNA ligáza IV je ATP-závislá DSB DNA ligáza a XRCC4 je jej kofaktor, ktorý ju stabilizuje, zosilňuje jej aktivitu a nasmerováva ju k miestu DSB. Dnl4 a Lif1 sú považované za kvasinkové ekvivalenty ľudskej DNA ligázy IV a XRCC4, pretože Dnl4 je ATP-závislá DSB DNA ligáza a Lif1 je jej stabilizujúci, stimulujúci a nasmerovávací kofaktor. Podobným spôsobom ako DNA ligáza IV a XRCC4, Dnl4 a Lif1 formujú vysoko stabilný komplex. Kvasinkový komplex má rovnaké biochemické aktivity ako ľudský komplex.

 

LIG4 syndróm

 

LIG4 syndróm je vzácne autozomálne ochorenie vznikajúce v dôsledku mutácií v géne pre DNA ligázu IV (LIG4). K dnešnému dňu boli identifikovaní štrnásti LIG4 pacienti, z ktorých každý má aspoň jednu mutáciu v LIG4 géne. Jeden pacient má s mutáciou asociované aj dva polymorfizmy.

 

Charakterizácia mutácií a polymorfizmov u LIG4 pacientov

 

Pacient	LIG4 genotyp	Zmena v proteíne	Stav
1 (180BR)	833 G→A	R278H	Homozygot
2 (411BR)	8 C→T, 26 C→T, 833 G→A	A3V, T9I, R278H	Homozygot
3 (2303) a 4 (2304)	1738 C→T, 2440 C→T	R580X, R814X	Heterozygot
5 (99P0149)	1406 G→A, 2440 C→T	G469E, R814X	Heterozygot
6 (3703)	2440 C→T	R814X	Homozygot
7 a 8	839 A→G, 1270-1274 AAAAG delécia	Q280R, posun v čítacom rámci v pozícii K424 generujúci predčasný STOP kodón	Heterozygot
9 (SC2)	1297-1299 CAA delécia	Delécia Q433	Homozygot
10 a 11	845 A→T, 1270-1274 AAAAG delécia	H282L, K424 posun v čítacom rámci generujúci predčasný STOP kodón	Homozygot
12	745 A→G, 1270-1274 AAAAG delécia	M249V, K424 posun v čítacom rámci generujúci predčasný STOP kodón	Heterozygot
13 a 14	1762-1764 AAG delécia	Delécia K588	Homozygot

 

Nedávne štúdie indikujú, že závažnosť klinických príznakov odráža vplyv mutačnej zmeny na funkciu proteínu. Konkrétne, DNA ligáza IV nesúca mutáciu R278H exprimovaná v podmienkach in vitro si zachováva vyššiu hladinu reziduálnej aktivity v porovnaní s DNA ligázami IV nesúcimi mutačné zmeny, ktoré boli identifikované v pacientoch s výraznejším klinickým prejavom (pacienti 3-5). Je preto pravdepodobné, že mierne redukovaná aktivita DNA ligázy zabezpečuje dostatočný nervový a imunitný vývoj, čo sa neprejaví žiadnym klinickým príznakom, ale vylučuje normálu odpoveď na rádioterapiu, ktorá generuje vysoké množstvo DSB. Je zaujímavé, že aj polymorfizmy (A3V a T9I) v DNA ligáze IV majú vplyv na funkciu proteínu. Hoci ich efekt nie je dramatický v inak divom type proteínu, ich vplyv je signifikantný, keď sú spriahnuté s R278H mutáciou a pravdepodobne je zodpovedný za rozdiel v klinickej závažnosti medzi jednotlivými LIG4 pacientmi. Toto je príklad, keď polymorfná zmena ovplyvňuje funkciu proteínu s veľmi pravdepodobným klinickým vyústením.

 

Lokalizácia mutácií a polymorfizmov nájdených v pacientoch s LIG4 syndrómom

 

 

 

A3V a T9I polymorfizmus a predispozícia k rakovine

 

Dedičné syndrómy sú spôsobené mutáciami, ktoré majú značný vplyv na funkciu proteínu. Avšak menej závažné mutácie a polymorfizmy môžu takisto zapríčiniť sporadické nádory. Na podporu tohto bolo ukázané, že dedičnosť LIG4 A3V CT (heterozygot) genotypu je signifikantne asociovaná s dvojnásobným poklesom risku ochorenia na mnohopočetný myelóm, a dedičnosť LIG4 T9I CT (heterozygot) a LIG4 T9I TT (homozygot) genotypov s jedenapolnásobným a štvornásobným poklesom risku tohto ochorenia. Tieto údaje teda naznačujú, že LIG4 A3V a T9I polymorfizmy majú v prírode protektívny účinok a znižujú risk ochorenia na mnohopočetný myelóm. Doposiaľ bolo nájdených 15 polymorfizmov v kódujúcej sekvencii LIG4 génu, z ktorých najfrekventovanejší je práve polymorfizmus LIG4 T9I.

Naše ciele

 

Hoci sa podarilo identifikovať zopár polymorfizmov, ktoré majú vplyv na funkciu proteínu, takéto štúdie sú častokrát limitované nedostatkom dostatočne citlivých metód v podmienkach in vivo. Napriek tomu bolo ukázané, že dva navzájom späté polymorfizmy v DNA ligáze IV (A3V and T9I) majú mierny vplyv na funkciu proteínu v podmienkach in vitro. Čo je však viac významné je fakt, že keď sú tieto dva polymorfizmy späté s mutáciou R280H, tak dochádza k aditívnemu vplyvu, čo má za následok závažnejší klinický fenotyp spôsobený pravdepodobne redukovanou aktivitou proteínu pod hladinu, ktorá je potrebná pre normálny vývoj (porovnaj pacientov 1 a 2). Tento fakt poukazuje na to, že prítomnosť polymorfizmov môže výrazne ovplyvniť vývoj jedinca. Okrem toho LIG4 A3V a T9I polymorfizmy v neprítomnosti R280H mutácie znižujú riziko chromozomálnej nestability a následnej malignancie, ako bolo pozorované pre mnohopočetný myelóm.

   Keďže oprava DNA má vysoko konzervovaný charakter, komponenty v nej zahrnuté sú častokrát schopné fungovať v heterológnych systémoch. V zhode s týmto boli kvasinky S. cerevisiae už niekoľkokrát použité ako hostiteľ pre horizontálny prenos génov, ktoré kódujú enzýmy a/alebo proteíny zahrnuté v oprave DNA u ľudí. Takéto štúdie viedli k preskúmaniu biologických a biochemických vlastností mnohých komponentov opravy DNA u ľudí.

   Funkcia dvoch hlavných komponentov ľudského NHEJ, KU70-KU80 a LX komplexov, je vysoko konzervovaná počas evolúcie,  hoci celková sekvenčná identita korešpondujúcich homológov v kvasinkách a ľuďoch je skôr nízka. Avšak bolo ukázané, že ľudský KU70 proteín je schopný funkčne kompenzovať stratu Yku70, čo naznačuje, že poznatky o NHEJ získané v kvasinkách môžu platiť aj pre ľudí, a že kvasinky môžu byť preto využité na zodpovedanie základných otázok týkajúcich sa procesu NHEJ.

   Ako bolo spomenuté vyššie, v cicavčích bunkách je nedostatok citlivých in vivo metód na stanovenie vplyvu polymorfizmov na funkciu proteínu. Jeden z prístupov, ktorý by mohol pomôcť vyriešiť tento problém je založený na použití modelových organizmov ako je S. cerevisiae, pre ktoré tieto metódy môžu byť pomerne jednoducho zavedené. Toto je však postavené na predpoklade, že polymorfné zmeny sú vysoko konzervované, čo nie je prípad DNA ligázy IV a Dnl4. Tento problém by mohol obídený heterológnou expresiou mutantných a polymorfných LX komplexov v kvasinkách. Takáto štúdia by mohla priniesť do bližšej korelácie nedávno publikované údaje z in vitro podmienok s detailnými in vivo výsledkami získanými z kvasiniek, hoci nejaké limitované in vivo údaje z cicavčích buniek už sú k dispozícii. Ďalšia charakterizácia ľudských mutantných a polymorfných LX komplexov v podmienkach in vivo by mohla zvýšiť naše vedomosti o vplyve mutácií a polymorfizmov na ľudské zdravie, špeciálne incidenciu nádorov vyplývajúcu z menej účinného a/alebo presného procesu NHEJ.

 

 

Ako postupujeme (aktualizované 19.5.2009)

 

V prvej etape riešenia projektu sme skonštruovali kvasinkový kmeň, ktorý exprimuje ľudský LX komplex divého typu. Ľudský LX komplex sme vniesli do kmeňa S. cerevisiae JKM 139 (MATa, hmrD::ADE1, hmlD::ADE1, ade1-100, leu2-3,112, lys5, trp1::hisG, ura3-52, ade3::GAL-HO). Pomocou PCR reakcie sme si vytvorili disrupčnú kazetu, ktorou sme vyradili kódujúcu oblasť LIF1 génu URA3 selekčným markerom, čím sme vytvorili lif1Δ0::URA3 derivát kmeňa JKM 139, ktorý sme označili AD 1392. Sekvenačnými reakciami sme overili správnosť tohto kmeňa.

 

 

 

 

Fenotypicky sme vyradenie LIF1 génu v kmeni AD 1392 overili stanovením schopnosti tohto kmeňa cirkularizovať linearizovanú plazmidovú DNA  (schéma tohto stanovenia je uvedená na obrázku nižšie).

 

 

 

 

Výsledok tohto stanovenia je zobrazený na nižšie uvedenom obrázku vľavo. Ako je evidentné, AD 1392 kmeň (lif1Δ0::URA3 derivát kmeňa JKM 139) je defektný v cirkularizácii plazmidovej DNA, čo svedčí o jeho defekte v procese NHEJ v dôsledku disrupcie LIF1 génu v tomto kmeni. Plazmidová DNA bola štiepená takými restrikčnými endonukleázami, aby boli generované nasledovné typy koncov DNA: 3' prečnievajúce konce, 5' prečnievajúce konce a tupé konce. Výsledky pre lif1Δ0::URA3 derivát sú normalizované k výsledkom získaným pre divý typ (JKM 139).

 

 

 

 

 

Pri závadzaní stanovenia schopnosti kvasinkových kmeňov cirkularizovať linearizovanú plazmidovú DNA sme narazili na niekoľko problémov, ktoré sa nám však podarilo postupne vyriešiť a patrične zodpovedať ich podstatu. V prvých experimentoch sme neboli schopní vidieť defekt kmeňa AD 1392 v procese cirkularizácie plazmidovej DNA štiepenej restrikčnou endonukleázou generujúcou 3' prečnievajúce konce (viď obrázok vyššie vpravo). Keď sme však použili na vytvorenie 3' prečnievajúcich koncov inú restrikčnú endonukleázu, tento problém sme odstránili (porovnaj obrázok vyššie vľavo a vpravo). Okrem toho sme opakovane pozorovali len mierny defekt AD 1392 kmeňa v procese cirkularizácie plazmidovej DNA štiepenej restrikčnou endonukleázou generujúcou tupé konce (viď oba obrázky vyššie). Ako sme zistili, tento fakt je spôsobený tým, že aj divý typ per se účinnejšie cirkularizuje plazmidovú DNA s 3' a 5' prečnievajúci koncami v porovnaní s tupými koncami (viď obrázok nižšie vľavo; výsledky pre linearizované plamidy sú normalizované k údajom získaným pre cirkulárny plazmid). Keď sa potom pri výpočtoch účinnosti cirkularizácie linearizovanej plazmidovej DNA údaje získané pre bunky defektné v NHEJ normalizujú k údajom získaným pre bunky divého typu, zohľadnením tohto faktu dostávame, že kmeň defektný v NHEJ je len mierne defektný v procese cirkularizácie plazmidovej DNA štiepenej restrikčnou endonukleázou generujúcou tupé konce. Testovali sme, či aj iné kmene divého typu vykazujú defekt v cirkularizácii plazmidovej DNA štiepenej restrikčnou endonukleázou generujúcou tupé konce. Použili sme kmeň JKM 179, ktorý sa od kmeňa JKM 139 líši iba párovacím typom, a kmeň W303, ktorý je úplne iného pôvodu. Výsledky týchto stanovení sú ukázané na obrázku nižšie v strede a vpravo. Ako je evidentné, všetky nami testované kmene divého typu vykazujú porovnateľný stupeň defektu v cirkularizácii plazmidovej DNA s tupými koncami. Z toho vyplýva, že defekt v cirkularizácii plazmidovej DNA štiepenej restrikčnou endonukleázou generujúcou tupé konce je do určitého stupňa vlastný aj bunkám divého typu, čo je v zhode s údajmi niektorých iných autorov. Určitý stupeň defektu v cirkularizácii plazmidovej DNA s tupými koncami v bunkách divého typu budeme musieť adekvátne v ďalších experimentoch zohľadniť.

 

 

Následne sme do kmeňa AD 1392 vniesli cDNA kódujúcu ľudský XRCC4 proteín podľa schémy uvedenej nižšie. Vytvorili sme tak kmeň AD X4, ktorý je lif1Δ0::XRCC4 derivátom kmeňa JKM 139.

 

V kmeni AD X4 (v štyroch nezávislých klonoch) sme overili expresiu ľudského XRCC4 proteínu anti-XRCC4 protilátkami (viď obrázok nižšie). Ako je evidentné, tri klony (20, 15 a 25) exprimujú ľudský XRCC4 proteín. Klon 20 bol následne sekvenovaný, aby sa overila sekvencia ľudskej XRCC4 cDNA.